实验用雌性Sprague-Dawley大鼠 (250～300 g)。 腹腔注射氨基甲酸乙酯 (1.5 g/kg)麻醉。 气管插管。沿正中线打开腹腔(3～4 cm), 腹主动脉插管, 管口靠近肾动脉开口处。小心游离左侧肾上腺, 确保肾上腺动静脉完整。轻轻将腺体抬高, 挂在特殊固定架的双钩上,使之不随呼吸而移动并确保血液供应。适当增加血管张力即可使肾上腺处于缺血状态。从腹主动脉给予ACh, 生理盐水对照。实验室温度保持在25±2℃。
碳纤维电极的制作方法与Wightman等人报道的类似［9］。本文方法是: 将长为2～3 cm的碳纤维(直径7 μm, Goodfellow Co. england)吸入长约5 cm的GG17玻璃毛细管(中国科学院上海生理研究所科达生物技术有限公司)的一端, 将该端朝上安装在微电极拉制仪(Narishige scientific Instrumental Lab, Japan)上使加热电阻丝位于碳纤维的上半段, 即可拉出玻璃密封和绝缘的碳纤维电极。最佳加热电流为11 a, 拉力为自身重力。在玻璃毛细管中填充石墨粉, 插入细铜丝作导线, 用环氧树脂将导线和毛细管固定。 最后用手术刀将伸出毛细管尖端的碳纤维切短,使其长度为100～200 μm。
髓质中儿茶酚胺的测定采用微电极在体伏安法［10］。将碳纤维电极固定在江湾I型C立体定向仪(上海第二军医大学)上, 调节电极尖端位置, 对准腺体中心,直至插入到肾上腺髓质中央。将甘汞参比电极和铂丝辅助电极放置在大鼠的腹腔中。通过循环伏安仪(中国科学院上海原子核研究所)在碳纤维工作电极上施加一定的电压。当电极探头周围存在容易被氧化的物质（如儿茶酚胺）时,这些物质就能通过扩散接近电极表面并失去电子, 产生法拉第电流, 经循环伏安仪的电流放大器放大后输出到XYT记录仪(上海大华仪表厂),就能检测到这些物质的电流信号。本实验根据不同实验目的,采用不同的伏安技术来测定髓质中儿茶酚胺的浓度。由于一般循环伏安法适合于检测恒定的或缓慢变化的浓度如基础浓度,而恒电位法适合于检测快速变化的浓度如激动剂引起的分泌。因此, 在测定基础和缺血状态的儿茶酚胺浓度以及鉴定检测信号的化学性质时,采用循环扫描伏安法。即在碳纤电极上施加在－0.20 V～+0.60 V 之间循环扫描（变化）的电压, 电压扫描速率为100 mV/s, 采样电位为+0.25V,连续循环扫描3～5周并取平均值, 采样间隔由实验情况决定。在检测ACh诱发分泌的儿茶酚胺时,采用间歇式恒电位伏安法。即于给药前后这段时间内在碳纤电极上施加+0.40 V 的电压。
实验结果如下:
1．电极的选择性和灵敏度
在肾上腺髓质中, 抗坏血酸的浓度比较高(250 μmol/L), 未处理的碳纤维电极对抗坏血酸和儿茶酚胺的氧化没有选择性［4］。因此为了排除抗坏血酸的干扰,必须对电极进行处理。本实验的处理方法是: 将电极浸入0.5 mol/L NaOH溶液中于-0.2～1.0 V 以100 mV/s循环扫描10 min,然后在1% Nafion乙醇溶液（一种阳离子交换剂,美国杜邦公司生产, 购自Sigma-Aldrich公司。5％（w/w）浓度的溶液型Nafion稀释后常用来修饰碳纤电极,排除抗坏血酸和DOPAC等阴离子生物小分子的干扰）中浸30 s并在100℃ 烘1 h。经此处理后,同样浓度的肾上腺素和抗坏血酸在电极上的氧化电流之比为1000∶1［11］, 抗坏血酸对儿茶酚胺的测定没有干扰。当采用恒电位（E=+0.4 V）方法进行测定时,肾上腺素在这种电极上的氧化电流与其浓度在0.1～50 μmol/L之间具有线性关系, 检测限为0.1 μmol/L。由于大鼠肾上腺髓质中肾上腺素与去甲肾上腺素之比为4∶1［12］, 而且去甲肾上腺素和肾上腺素在碳纤维电极上的氧化电位、选择性相同（虽然肾上腺素在+1.3 V 的高氧化电位下能出现第二个氧化峰,但本实验的氧化电位在＋0.60 V 内, 它们的第一个氧化峰是重叠的）［12］, 因此本实验所检测的是去甲肾上腺素和肾上腺素（儿茶酚胺）的总浓度。
由于在体测定后电极的灵敏度有所下降, 因此实验后必须取出电极进行后校正。校正方法是将电极取出后用蒸馏水冲洗掉表面粘附的血液和蛋白质, 浸入含250 μmol/L抗坏血酸和加入0～10μmol/L肾上腺素的磷酸缓冲液（pH 7.4）中, 用与在体检测时相同的伏安法（间歇式恒电位或循环伏安法）测定不同浓度的肾上腺素在电极上的氧化电流,绘制校正曲线。最后将实验数据插入校正曲线中求出相应的儿茶酚胺浓度。在体测量后电极的灵敏度会下降60%左右, 但其对儿茶酚胺的响应仍保持线性关系。
2. 电极位置的确定和分泌物的鉴定
肾上腺素在循环伏安曲线上的氧化峰电位为+0.25 V, 当插入肾上腺的电极检测到肾上腺素特征氧化峰时, 说明电极已插入到髓质的嗜铬细胞群中,所检测的分泌物为儿茶酚胺。
3. 基础水平和缺血的影响
在部分实验中, 我们使用了循环伏安法和间歇恒式电位法两种技术。在测定大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺的基础水平和缺血不同时间后的水平时, 均采用循环伏安法,即在每个采样时间点于-0.20 V～+0.60 V之间循环扫描3～5周。由于自发分泌信号变化较快, 因此在监测其分泌的最大幅度时,采用了恒电位伏安法。本实验统计结果表明, 大鼠腺髓质中儿茶酚胺的基础浓度为0.1～0.5 μmol/L（n=10）。由于肾上腺抬高后很容易导致缺血,因此研究了缺血对分泌的影响。当腺体轻度缺血时（缺血2～5 min）,髓质儿茶酚胺浓度升高到0.5～2 μmol/L, 严重缺血时(缺血10～60 min)可达到5～30 μmol/L。在实验中, 我们发现肾上腺髓质能自发分泌儿茶酚胺。不缺血时, 17次实验中观察到4次自发分泌, 其幅度比较小,最大的一次为9 μmol/L, 出现的频率比较低; 缺血时, 17次实验中观察到8次自发分泌, 其幅度和频率度增加了, 最大幅度达到28 μmol/L,最大频率达到5次/20 min。
4． 乙酰胆碱引起的儿茶酚胺分泌
支配肾上腺髓质的交感神经末梢释放的递质是乙酰胆碱, 因此我们用乙酰胆碱来刺激肾上腺髓质分泌儿茶酚胺。在体情况下,持续恒电位方法会使碳纤电极的灵敏度下降,通过研究我们发现采用间歇式恒电位方法可使电极的灵敏度得到很大恢复。也就是说, 在每次给予ACh之前2 min开始在工作电极上加上+0.4 V 电压并保持5 min, 其它时间使电极处于开路状态。连续两次给予ACh的时间间隔一般不小于15 min。通过腹主动脉给予乙酰胆碱, 每次给予100 μl,给药时间间隔为15～20 min。乙酰胆碱能剂量依赖性地刺激肾上腺髓质分泌儿茶酚胺。大鼠对乙酰胆碱敏感性存在一定的差异。
由于大鼠肾上腺位于膈肌下面,容易受呼吸的影响, 因此肾上腺的固定是本实验成功的关键。当腺体抬得太高时很容易造成缺血, 使ACh不能到达髓质中。因此,本实验中基础浓度的测定以及ACh刺激的分泌实验都是在腺体固定得非常好的情况下进行的,这样的成功机会只有25%。实验测得大鼠肾上腺髓质中儿茶酚胺的基础浓度为0.1～0.5 μmol/L。这与人的肾上腺静脉血中儿茶酚胺的浓度（0.27 μmol/L）可以相比较（至今还没有大鼠肾上腺静脉数据可直接比较）［1］。缺血时肾上腺中儿茶酚胺浓度大大增加, 而且自发分泌的幅度和频率也相应增加, 说明缺血对动物是一种强烈的应激。经腹主动脉给予乙酰胆碱能刺激肾上腺髓质分泌儿茶酚胺, 而且具有量效关系, 与Wakade的离体灌流结果相符合［2］。肾上腺髓质在不缺血时也有小幅度和低频率的自发分泌。本文在肾上腺髓质中儿茶酚胺的在体伏安法测定方面为首次报道。
corresponding author. Present addres: Institute of Biophysics and Biochemistry, huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074;
tel: 027-87543104; E-mail: zcg999@990.net张春光(第二军医大学基础部生理学教研室)
徐建军(第二军医大学基础部生理学教研室)
陈宜张(第二军医大学基础部生理学教研室)
陈宜张(神经生物学教研室, 上海 200433)
参 考 文 献
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received 1999-07-16 Revised 1999-09-28
